### 下一代全基因組人源化小鼠構(gòu)建技術(shù)

尊龍凱時(shí)在傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞（ES）打靶技術(shù)的基礎(chǔ)上，推出了升級(jí)版的TurboKnockout?基因編輯技術(shù)。該技術(shù)利用優(yōu)化的純合ES克隆打靶體系，能夠高效篩選進(jìn)行基因敲除、敲入及點(diǎn)突變的純合ES細(xì)胞。通過結(jié)合囊胚前注射與四倍體補(bǔ)償技術(shù)進(jìn)行顯微注射，確保產(chǎn)生的Founder小鼠達(dá)到100%嵌合狀態(tài)，所有組織細(xì)胞均完全由外源ES細(xì)胞分化而來，從根本上解決了傳統(tǒng)技術(shù)中嵌合體比例不穩(wěn)定的問題。

這一基因編輯技術(shù)的周期縮短至3個(gè)月，可大批量獲得基因一致的純合子小鼠。經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，TurboKnockout?技術(shù)在確保100%嵌合率的同時(shí)，也展現(xiàn)出卓越的穩(wěn)定性。其流程包括：載體構(gòu)建→ES打靶→PCR/FACS驗(yàn)證→陽性胚胎制作→“100%”嵌合F0胚胎及小鼠生產(chǎn)→嵌合率驗(yàn)證。

首先，我們構(gòu)建了Rosa26安全位點(diǎn)過表達(dá)載體CAGLuciferaseEGFP質(zhì)粒，并在C57BL/6NWTES細(xì)胞上獲得PCR正確的陽性克隆。隨后，通過流式細(xì)胞儀驗(yàn)證EGFP的正確表達(dá)。

接下來，我們將獲得的陽性ES克隆進(jìn)行顯微注射，產(chǎn)出陽性Founder小鼠，再通過常規(guī)傳代獲得純合F2代雄鼠。F2雄鼠與C57BL/6NWT雌鼠交配生成可用于TurboKnockout?技術(shù)顯微注射的陽性受體胚胎。通過顯微注射C57BL/6NWT的ES細(xì)胞和未注射的空扎受體胚胎，分別獲得125d胚胎及4周齡的Founder小鼠，并驗(yàn)證其Luciferase與EGFP的表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，125d的空扎胚胎與注射C57BL/6NWTES細(xì)胞的胚胎在EGFP表達(dá)上存在顯著差異。在這兩種胚胎經(jīng)過單細(xì)胞解離后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，空扎胚胎相對(duì)注射C57BL/6NWTES細(xì)胞的胚胎EGFP均有表達(dá)，同時(shí)未檢測到EGFP陽性細(xì)胞的泄露表達(dá)。

將空扎胚胎和注射了WTES細(xì)胞的胚胎分別移植到ICR代孕鼠體內(nèi)，出生的Founder小鼠在4周齡時(shí)進(jìn)行活體成像。結(jié)果表明，注射C57BL/6NWTES細(xì)胞的胚胎未見Luciferase熒光泄露，而空扎的胚胎發(fā)育的小鼠則表現(xiàn)出顯著的Luciferase強(qiáng)熒光，差異呈顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為了進(jìn)一步確認(rèn)注射了C57BL/6NWTES細(xì)胞的胚胎是否具有CAGLuciferaseEGFP細(xì)胞嵌合性，對(duì)注射了WTES細(xì)胞的4周齡小鼠及125d胚胎的各個(gè)組織進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并添加空扎胚胎作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，注射C57BL/6NWTES細(xì)胞的F0小鼠各組織和胚胎均未檢測到MT條帶。

總結(jié)而言，TurboKnockout?技術(shù)生成的Founder小鼠為100%嵌合狀態(tài)，所有組織細(xì)胞均由外源ES細(xì)胞分化而來，顯示出其在基因編輯上的顯著優(yōu)勢。

### TurboKnockout?基因編輯技術(shù)優(yōu)勢

1. **編輯類型多樣化**：能夠進(jìn)行多種項(xiàng)目類型的基因修飾，如基因敲除、敲入、點(diǎn)突變或人源化等；

2. **QC體系多樣化**：除了常規(guī)PCR鑒定，技術(shù)還支持多種方法質(zhì)檢（QC）ES克隆打靶的準(zhǔn)確性，包括染色體核型鑒定、Southern Blot鑒定、qPCR鑒定及FACS鑒定等；

3. **F0基因型穩(wěn)定**：結(jié)合法律保護(hù)的TurboKnock顯微注射技術(shù)和四倍體補(bǔ)償技術(shù)，確保所有交付的F0代小鼠基因型一致，基因修飾準(zhǔn)確、效果穩(wěn)健；

4. **品系選擇靈活**：尊龍凱時(shí)提供C57BL/6NCya、C57BL/6JCya、BALB/cAnCya、129S2/SvPasCya等多種品系選擇。

### TurboKnockout?基因編輯小鼠模型

1. **HUGO-GT?全基因組人源化模型**：在尊龍凱時(shí)自主研發(fā)的TurboKnockout?技術(shù)基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建涉及更多干預(yù)靶點(diǎn)的全基因組人源化小鼠。這些HUGO-GT?小鼠整合了更高效的大片段載體融合技術(shù)，能夠作為高效的模板進(jìn)行有針對(duì)性的突變定制，深度貼合真實(shí)生物機(jī)制的藥物臨床前研究。同時(shí)，基于HUGO-GT?小鼠的基礎(chǔ)上，尊龍凱時(shí)還提供眼科、神經(jīng)、腫瘤免疫等領(lǐng)域的CRO服務(wù)，推進(jìn)遺傳性疾病研究及基因治療藥物的開發(fā)。

2. **HUGO-Ab?全人源抗體小鼠**：基于全人抗體藥物研發(fā)的需求，尊龍凱時(shí)運(yùn)用創(chuàng)新技術(shù)和TurboKnockout? ES打靶技術(shù)，構(gòu)建了下一代HUGO-Ab?全人源抗體小鼠，攜帶完整的人類免疫球蛋白基因，能夠在體內(nèi)產(chǎn)生高親和力、低免疫原性的全人源抗體。在抗體發(fā)現(xiàn)過程中，系列產(chǎn)品如HUGO-Mab?、HUGO-Light?和HUGO-Nano?展示了豐富的抗體序列多樣性，已經(jīng)得到多家跨國藥企和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可，成為治療性抗體新藥開發(fā)的強(qiáng)大助力。

此外，尊龍凱時(shí)還提供多種基因編輯定制服務(wù)，包括完全性基因敲除小鼠、條件性基因敲除小鼠、基因敲入小鼠以及利用KO-First技術(shù)靈活構(gòu)建小鼠，以滿足不同研究需求，為藥物篩選、信號(hào)通路分析和遺傳機(jī)制解析提供高效工具。