簡介
1992年，Manfred Gossen和Hermann Bujard進行了開創性的研究，開發了
尊龍凱時的Tet-off系統。相關研究成果以“Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters”為題發表在PNAS期刊。Tet-on/Tet-off系統是分子生物學和基因工程中最經典、應用最廣泛的可誘導基因表達系統之一。該系統源于大腸桿菌的轉座子Tn10四環素（Tetracycline, Tet）抗性操縱子（TetO），主要由Tet響應元件（TRE，由7個重復的TetO序列組成）、Tet阻遏蛋白（TetR）及其改造蛋白等組成，能夠在真核細胞（如哺乳動物細胞）中精確、可逆、劑量依賴性地控制目標基因的開啟或關閉。
基本原理
TetR能夠與TetO特異性結合。當細胞內沒有Tet時，TetR會與TetO結合，從而阻斷下游抗性基因的表達。而當細胞內有Tet時，TetR的構象發生變化，使其與TetO分離，從而解除對抗性基因的抑制，導致抗性蛋白的表達，令細菌產生耐藥性。
01 Tet-off系統原理
tTA是由TetR與單純皰疹病毒VP16蛋白C端的一段轉錄激活結構域融合而成的蛋白，是四環素阻遏轉錄激活因子。當不存在多西環素（Doxcycline, Dox）時，tTA與TRE結合，啟動下游基因的表達；而當Dox存在時，tTA的構象發生改變，從TRE上脫落，導致下游基因表達關閉。
02 Tet-on系統原理
反義tTA（rtTA）是由反義TetR（rTetR）及單純皰疹病毒VP16蛋白C端的轉錄激活結構域融合而成，它的表型與tTA相反。rtTA只有在存在四環素時才激活TRE。當Dox不存在時，rtTA無法結合TRE，導致下游基因表達關閉；而當Dox存在時，rtTA的構象變化使其結合TRE，開啟下游基因的表達。
關鍵特性與優勢
01 高度嚴謹
在未誘導狀態下（Tet-off有Dox；Tet-on無Dox），背景泄露表達非常低。而在誘導狀態下（Tet-off無Dox；Tet-on有Dox），表達水平可接近強組成型啟動子。
02 可逆性
通過添加或撤除Dox，可以快速、反復地開啟或關閉基因表達，這對研究基因功能的動態變化至關重要。
03 劑量依賴性
基因表達的水平可通過Dox的濃度進行精細調控（在有效濃度范圍內，濃度越高，Tet-on誘導越強，Tet-off抑制越強）。
04 快速響應
Dox作為小分子，能迅速穿透細胞膜（包括血腦屏障）。添加Dox后，基因表達通常在數小時（mRNA）到一兩天（蛋白）內顯著變化；撤除Dox后表達亦相應下降。
05 低細胞毒性
在常用濃度范圍內，Dox對多數細胞類型的毒性很低，適合長期實驗和體內研究。
06 廣泛適用性
已成功應用于小鼠、大鼠等多種模式生物。
應用場景
1. 功能基因研究
1）在特定時間、細胞類型或組織中誘導表達某個基因，研究其過表達對細胞表型、信號通路、發育或疾病進程的影響。 2) 在轉基因動物（如小鼠）中實現時空特異性的基因表達。例如，利用組織特異性啟動子驅動rtTA/tTA表達，通過Dox給藥控制目標基因在特定組織（如肝臟、大腦）和特定時間（如成年期）內的開啟或關閉。
2. 神經科學研究
可結合光遺傳學、鈣成像等技術，研究神經系統的功能和機制。利用Tet-off系統與光敏蛋白結合，標記小鼠大腦中與恐懼記憶相關的細胞，通過光遺傳激活這些細胞，研究記憶的編碼、存儲和提取機制。
客戶案例分享
客戶文章（IF=81）：Yu Y. M. et al. An accumbal microcircuit for the transition from acute to chronic pain. Curr Biol 2025 Apr 21; 35(8): 1730-1749 e5. doi:10.1016/j.cub.202502055. Epub 2025 Mar 19. PMID: 40112811。
尊龍凱時的病毒使用案例： AAV2/9-cfos-tTA-WPRE-hGHpA AAV2/9-TRE-tight-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-hGHpA AAV2/9-TRE3g-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGHpolyA AAV2/9-TRE3g-hChR2(E123T/T159C)-mCherry-WPRE-hGHpA 研究者通過tTA-TRE（Tet-Off）系統特異性標記了不同類型急性疼痛（如足底注射辣椒素/CAP、坐骨神經慢性壓迫性損傷/CCI）。結果表明，盡管急性疼痛可以同時激活NAcS和NAcC神經元，但在疼痛消退后數天，只有NAcS神經元的再激活能夠誘發小鼠的疼痛反應。這一發現表明，早期被疼痛激活的NAcS神經元在慢性疼痛發展中發揮重要作用，可能成為調控疼痛慢性化的一個潛在啟動器。
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